導語：

補料作為fedbatch的營養(yǎng)補充劑，一般由消耗量較大的成分組成，如氨基酸、維生素等，其組分濃度高，滲透壓高，在批次補料中至關重要，開發(fā)極具挑戰(zhàn)性，需要恰當?shù)某煞郑m宜的濃度，所謂藝術難在平衡，在補料開發(fā)上亦是如此。目前市面上的商業(yè)化補料種類并不多，市場基本被業(yè)界的三巨頭（Gibco、Hyclone、Merck）壟斷，迫于進口產(chǎn)品居高不下的價格，以及未來對于持續(xù)性供貨的擔憂，國產(chǎn)化補料已經(jīng)順勢崛起。

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補料的重要性

那補料到底有多重要，小編先貼組數(shù)據(jù)，選擇一款頂尖的商業(yè)基礎培養(yǎng)基進行batch培養(yǎng)，同時使用商業(yè)化補料進行fedbatch作為對照組，試驗細胞為表達某雙抗的CHO-K1單克隆細胞株。

沒有什么比數(shù)據(jù)更有說服力的了。Batch培養(yǎng)的細胞也有生長對數(shù)期、平臺期和凋亡期，但凋亡期活率下降很快，12天活率僅剩82.4%，表達量是1.24g/L，再看對照組，第11天的表達量達到4.52g/L，第14天活率還有88%。可見補料在細胞培養(yǎng)及蛋白表達上的重要性。接下來小編又換了一個基礎培養(yǎng)基（皓陽培養(yǎng)基），進行了相同的實驗。

很明顯，換了基礎培養(yǎng)基后，補料仍舊不可或缺，但是這次使用皓陽基礎培養(yǎng)基后，細胞生長的狀態(tài)稍有改善，第11天的表達量有2.91g/L，能達到對照組的61%，只是從11天開始表達量原地不動，細胞只存活，不表達，也實在是無米可用。兩個小實驗對比可以發(fā)現(xiàn)，同樣是基礎培養(yǎng)基batch培養(yǎng)，生長及表達差距甚遠，可能是基礎中不同的組分及濃度造成了這個差異，到底是哪些成分的濃度差異導致，由于商業(yè)基礎培養(yǎng)基的成分不明確，這里只能是一個迷。

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補料的搭配組合

一般補料為一個主體補料搭配一個堿性補料，堿性補料成分比較清晰，為幾個難溶性氨基酸，如酪氨酸等。小編用僅含氨基酸、維生素和幾個鹽的補料（皓陽補料），以皓陽培養(yǎng)基為基礎，與上述商業(yè)化補料進行了比對研究。

使用皓陽基礎培養(yǎng)基僅補料商業(yè)補料，不補堿性補料，最后表達量為2.65g/L，與batch試驗中的結果相當甚至更低，前期細胞生長與活率維持與另兩組相似，后期維持很差，結束時活率甚至低于batch水平，表達量結果與batch相似，第11天后就停止表達，猜測是商業(yè)化補料中完全不含堿性補料中的某個或某幾個氨基酸，導致細胞前期能利用基礎中的含量進行生長和適當?shù)谋磉_，后期不斷補入的營養(yǎng)成分由于無法利用反而成為了負擔。再看皓陽補料，不補堿性補料后，表達量能達到5.36g/L，而補堿性補料后表達量為6.04g/L，比例達到88.7%，可能因為開發(fā)補料中含一定濃度的難溶性氨基酸，但濃度又不夠，有文獻報道過，將正常補料中的半胱氨酸濃度降低15%后，抗氧化物谷胱甘肽和牛磺酸等會減少，導致細胞在后期維持氧化還原的能力大大降低，活率下降，最終導致蛋白表達下降，這與本實驗結論一致。

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補料對titer影響

皓陽補料第14天表達量有6.04g/L，能達到商業(yè)補料90%以上的水平，勝利在望，小編不能停下腳步，這次仍使用皓陽基礎，將上述補料中20種氨基酸和11種維生素設了兩個濃度，大部分氨基酸濃度差異較小，在2-5倍之間，個別特殊氨基酸如丙氨酸、甘氨酸酪氨酸等濃度設計差異較大，達到6-7倍以上，維生素的濃度差異較寬，在3倍至100倍之間不等，一共設計了32組PB（Plackett-Burman）試驗，再加一組對照（33號，皓陽基礎+商業(yè)補料）。

就不吐槽這個實驗前期培養(yǎng)基配制工作有多復雜，結果卻讓小編大失所望，所有實驗組均低于對照組，最高的只有5.15g/L，只有對照組的80.7%，而最低的為2.32g/L，連batch的表達水平都沒達到，這細胞就是這么任性，營養(yǎng)不對胃口，就不吃也不吐。

雖然實驗沒有預期的結果，小編也沒有挖掘到什么有價值的信息，只感覺添加不同濃度氨基酸和維生素對細胞生長影響沒那么大，但對蛋白表達的影響卻非常大，這次小編給自己減負，將氨基酸濃度卡住不動，單獨對維生素進行了探索，但濃度范圍作了適當?shù)恼{整，高低在2-200倍之間，設計了12組PB與一組對照（13號，皓陽基礎+商業(yè)補料）。

先看對照組，這個皓陽基礎加商業(yè)補料的CP組合，從第二個實驗的6.54g/L，到第四個實驗的6.38g/L，再到本次的6.34g/L，可以說是非常的穩(wěn)定。實驗組活率到第11天為止基本一致，最后一天表現(xiàn)出了較大的差異，第14天最低活率是19%，最高活率有91%，活細胞密度情況相似，最后一天從22.7E6cells/ml到4.23E6cells/ml，也就是不同的維生素濃度對細胞后期的狀態(tài)維持有較大的影響，分析得出結果對于活率密度維持及蛋白表達最重要的一個因子是氯化膽堿，這與文獻報道一致。

04

補料定制開發(fā)對宿主的意義

雖然文獻早有報道，但小編還是暗自驚喜，至少有兩款能與商業(yè)補料媲美的補料， fedbatch最后第14天的表達量能達到6.4g/L，于是小編又精神抖擻，繼續(xù)搬磚，這次用表達另一蛋白的CHOK1單克隆細胞，選取上述第11（皓陽補料1）和第12號補料（皓陽補料2）進行了試驗。

皓陽基礎搭配商業(yè)補料表現(xiàn)依舊出色，表達量為最高，達到4.86g/L，但皓陽補料無論是1或2，最后表達量僅有3.5g/L，有點不忍直視。所以可見，雖為同一宿主細胞，不同項目之間的差距，揭示了不同項目量身定制化開發(fā)的重要性。

經(jīng)驗分享與感悟

直到現(xiàn)在，因為細胞代謝的錯綜復雜，我們對它的認知仍是冰山一角，作為一名工藝人，在開發(fā)路上翻山越嶺，披荊斬棘，只愿所有迷惑，皆為可解。

參考文獻

1.Shinobu Kuwae?,?Ichiko Miyakawa?,?Tomohiro Doi?, Development of a chemically defined platform fed-batch culture media for monoclonal antibody-producing CHO cell lines with optimized choline content. Cytotechnology .2018 Jun;70(3):939-948.? ? ? ?

2.Amr S. Ali?,?Rachel Chen?,?Ravali Raju?,?Rashmi Kshirsagar. Multi-Omics Reveals Impact of Cysteine Feed Concentration and Resulting Redox Imbalance on Cellular Energy Metabolism and Specific Productivity in CHO Cell Bioprocessing. Biotechnol J.2020 Aug;15(8):e1900565.

關于皓陽生物

杭州皓陽生物技術有限公司成立于2015年11月，是一家從事治療性抗體和重組蛋白藥物開發(fā)服務的國家高新技術企業(yè)。公司擁有抗體藥物人源化和成藥性分析、穩(wěn)定細胞株構建、發(fā)酵工藝開發(fā)、純化工藝開發(fā)、制劑處方開發(fā)、分析方法開發(fā)、抗體偶聯(lián)藥物（ADCs）開發(fā)、培養(yǎng)基定制開發(fā)等多個藥物開發(fā)平臺，建有完善的1000L規(guī)模原液和成品GMP生產(chǎn)線，能夠提供從DNA到IND和臨床Ⅰ、Ⅱ期樣品生產(chǎn)一站式純粹與專業(yè)CDMO服務。公司現(xiàn)有研發(fā)實驗室面積5000平方米，總投資近億元。自成立以來，公司為國內(nèi)外多個新藥研發(fā)企業(yè)提供生物藥物技術研發(fā)服務，同時與多家知名醫(yī)藥公司達成戰(zhàn)略合作。

?皓陽生物致力于通過新藥研發(fā)，推動生物醫(yī)藥領域的進步，實現(xiàn)創(chuàng)新為民、科技惠民的創(chuàng)業(yè)目標。公司立足中國，實踐?“聆聽 深耕 開拓 共贏”的企業(yè)精神，努力打造一個行業(yè)地位突出，管理先進的現(xiàn)代化企業(yè)。